实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义

       乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10％。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能 发展 为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。荧光PCR技术融合了PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，而且整个实验过程均在完全封闭的状态下进行，不需要PCR的后处理和电泳检测，解决了PCR定量和防污染等 问题 ，而且具有快速、准确、特异等优点。本文以472例血清标本分别用ELISA法和实时荧光PCR法分别对乙肝标志物和HBV进行检测，报告如下。

　　1　资料与方法

　　1.1　血清标本来源　472份血清标本均取自2005年1月至2005年10月我院门诊及住院的患者。其中，男245例，女227例；平均年龄35.2岁。

　　1.2　血清标本的采集　采用灭菌的一次性带盖塑料管，清晨空腹抽取静脉血5 ml，离心分离血清，-20 ℃冻存备用，集中检测。

　　1.3　方法

　　1.3.1　试剂　采用中山公司生产的乙肝两对半试剂盒，用ELISA法分别对472例血清进行HBV两对半进行检测并依据检测结果进行分组。分组如下：A：HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)(大三阳)；B：HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)(小三阳)；C：HBsAg(+)、HBcAb(+)；D：HBsAb(+)；E：HBeAb(+)、HBcAb(+)；F：HBsAg(-)、HBsAb(-)、HBeAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)。

　　1.3.2　荧光定量PCR检测HBVDNA含量　采用深圳匹基公司博日荧光定量PCR系统，按照试剂盒说明书操作程序对上述血清标本进行检测。

　　1.3.2.1　HBVDNA提取　血清100 μl加DNA提取液1 100 μl,13 000 r/min离心10 min→弃上清→再加提取液Ⅱ 25 μl,振摇10 s→100 ℃10 min→13 000 r/min离心10 min，上清液备用。

　　1.3.2.2　扩增　取上清液2 μl，加入盛有扩增反应液38 μl(含引物，dNTPs，Taq酶及PCR缓冲液)的PCR反应管中，扩增40个循环，循环参数为37 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min；60 ℃ 30 s。

　　1.3.2.3　使用博日实时荧光PCR定量DNA分析检测仪，并根据纯化HBVDNA建立的直线回归方程，直接作HBVDNA定量分析和数据读取，结果＜1.00×103 copy／ml为阴性。

2　结果

　　实时荧光PCR检测结果，见表1。

　　表1　实时荧光PCR检测结果（略）

　3　讨论

血清HBV标志物(HBVM)的检测给临床诊断乙肝病毒感染提供了较便捷的诊断依据。在临床应用过程中发现由于病情的发展过程的结局的多样性，尤其是肝功正常而体内确实有病毒复制者的治疗中，定量PCR检测HBVDNA为HBV感染及其疗效的判定提供了一项重要指标。诊断乙型肝炎及了解病毒复制状态的检测指标主要包括两部分：病毒DNA的表达物及其抗体应答系统；病毒DNA。ELISA方法一直是临床诊断HBV感染的传统手段，它实际就是检测病毒DNA的表达物及应答系统［1］，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，结果特异、准确。本研究对92份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有89份HBVDNA为阳性，阳性率达到96.7％，其PCR定量拷贝数为(3.23±1.45)×107/ml，文献报道有些出入［2］；168份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有118份HBVDNA阳性，阳性率为70.2％，PCR定量拷贝数为(4.65±2.10)×105/ml，文献报道基本一致［3］；32份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有11份HBVDNA为阳性，阳性率为34.4％，PCR定量拷贝数为(1.92±1.54)×104/ml；62份HBsAb(+)的标本HBVDNA阳性2例，阳性率为3.2％，PCR定量拷贝数为(5.45±1.14)×103/ml；60份全阴性的标本HBVDNA阳性1例，阳性率为1.7%，PCR定量拷贝数为(2.36±1.12)×104/ml。一般来说，乙型肝炎患者血清中HBsAg、HBeAg、HBeAb(+)、HBsAg、HBcAb(+)和HBsAg、HBeAb、HBcAb(+)3种不同情况，其血清HBVDNA载量不同，反映体内HBV复制的活跃程度不同，因而HBVDNA的含量变化与HBV血清标志物的变化基本相一致。有些HBsAb阳性的血清标本能检出HBVDNA，这可能是体内的HBV成为免疫或疫苗逃逸株，使体内的HBsAb不能完全清除血中的HBV，提示这些患者体内仍有HBV复制。由于HBVDNA的定量采用了实时荧光PCR检测法，即使存在很微量的HBVDNA也能测出。本文同时发现有3例大三阳患者，其血清PCR为阴性，这种情况应考虑是否HBV基因的S区发生有意义的点突变或插入、缺失突变［4］，而导致PCR结果为阴性。有些单项HBeAb和HBcAb阳性的患者，可能其血中HBsAg浓度处于不能被检出的低水平(低于ELISA法的检测下限)或S区基因发生变异使HBsAg未被检出，而PCR法具有很高的灵敏度，因此在这些标本中HBVDNA有较高的检出率。当HBV的X区发生变异使HBV处于低水平复制［5］，患者的体液免疫对HBV处于低应答状态，血清中的HBsAg和HBcAb处于较低水平而未被检出等情况下，也可引起HBV血清学标志物阴性而HBVDNA阳性的结果。从上表结果还可看出，大三阳、小三阳患者血清中PCR结果拷贝数均较高，而HBsAb阳性或HBsAg阴性的标本，即便PCR结果阳性，但其拷贝数也是很低。综上所述，大部分乙肝患者定量PCR检测HBVDNA的结果与HBV血清学标志物检测结果一致，但由于受到HBV基因包括S区、前C区等部X发生变异的影响，可引起HBV呈低水平复制，血清中HBsAg未能被检出或HBsAb不能有效清除血清中的HBV,血清中HBVDNA载量处于很低水平等，造成少数患者两种检测结果的不一致。本文检测结果表明，定量PCR检测HBVDNA在判断体内HBV是否在复制、复制的程度、HBV是否被清除，以及对HBV血清学标志阴性肝炎患者的诊断等方面，均优于HBV血清学标志物的检测，值得临床应用。

　　参考文献：

　　［1］　Saito T,Shinzawa H,Uchida T,et al.Quantitative DNA analysis of lowlevel hepatitis Bviremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B［J］.J Med Virol,1999,58:325.

　　［2］　赖宏芳，付晓野，董玉琳，等.荧光探针定量PCR检测HBVDNA［J］.上海：上海医学检验学杂志，2000，15(1)：1819.

　　［3］　周美霞，张钧，王田春.乙肝病毒DNA、前S1抗原及e抗原在慢性乙肝中的临床意义［J］.临床荟萃，2004，24(19)：13941396.

　　［4］　何印蕾.乙肝患者血清前S1抗原检测及其临床价值［J］.右江医学，2005，33(2)：154155.

　　［5］　Weinberger KM,Zoulek G,Bauer T,et al.A novel deletion mutant of hepatitis B virus surface antigen.J med Virol,1999,58:105.